Das Team um Dr. Chen Song aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. J?rg Matysik vom Institut für Analytische Chemie an der Universit?t Leipzig hat einen neuartigen Ansatz zur Probenvorbereitung für Festk?rper-NMR-Untersuchungen des enzymatischen PET-Abbaus entwickelt. Dabei wurde das polyesterspaltende Enzym TfCut2 zusammen mit dem Substrat PET in eine glasartige Matrix eingebettet. ?Für unsere Studie haben wir zudem kurzkettiges (fachsprachlich: oligomeres) 13C-isotopenmarkiertes PET verwendet, das wir, da es kommerziell nicht erh?ltlich ist, in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis um Prof. Dr. Michael Sommer von der TU Chemnitz synthetisiert haben. Der Einsatz des oligomeren PET-Substrats ist besonders, da in vorherigen Studien (aufgrund praktischer Schwierigkeiten) nur kleine, l?sliche und nicht-hydrolisierbare Modell-Substrate verwendet wurden, welche die Eigenschaften einer langen PET-Polymerkette kaum repr?sentieren k?nnen“, sagt Patricia Falkenstein aus dem Arbeitskreis von Prof. Matysik.
Falkenstein konnte so den enzymatischen PET-Hydrolyseprozess mithilfe zeitaufgel?ster Festk?rper-NMR-Daten in Echtzeit verfolgen und PET-Kettendynamiken untersuchen. In Kombination mit neuartigen Molekulardynamik (MD)-Simulationen, die vom Kooperationspartner am Institute of Marine Sciences in Barcelona durchgeführt wurden, konnten au?erdem spezifische Enzym-Substrat-Wechselwirkungen w?hrend des Abbauprozesses identifiziert werden.
Mithilfe dieser experimentellen Daten konnte schlie?lich ein Mechanismus für den enzymatischen PET-Abbau abgeleitet werden: Die polymere PET-Kette wird durch das Enzym TfCut2 zun?chst in kleinere Einheiten gespalten, die mindestens aus einer Wiederholeinheit (Monohydroxyethylterephthalat, MHET) bestehen. Diese werden in einem zweiten Schritt weiter in die Endprodukte Terephthals?ure (TPA) und Ethylenglykol (EG) gespalten. Dabei ist w?hrend des Abbauprozesses nur eine PET-Wiederholeinheit an das Enzym gebunden, w?hrend der Rest der PET-Kette nur lose an das aktive Zentrum gebunden ist. Die sogenannte ?Subsite II“ (Bindungsstelle II) des Enzyms unterstützt stattdessen das Gleiten der PET-Kette in das aktive Zentrum, so dass ein schrittweiser Abbau des polymeren Substrats an der ?Subsite I“ (Bindungsstelle I) erm?glicht wird.
?Diese Ergebnisse widersprechen der früheren Annahme, dass die PET-Kette w?hrend des enzymatischen Abbauprozesses mit mehreren Wiederholeinheiten an das Enzym gebunden ist. Der ursprüngliche Vorschlag basierte jedoch in erster Linie auf molekularen Docking-Studien, die m?glicherweise die Flexibilit?t der PET-Kette am aktiven Zentrum des Enzyms nicht ausreichend gut widerspiegeln. Insgesamt erm?glichen unsere Ergebnisse ein neues Verst?ndnis des biokatalytischen PET-Abbaumechanismus von Polyesterhydrolasen“, sch?tzt Prof. Dr. J?rg Matysik ein. Au?erdem berge die Arbeit interessante Ans?tze für die Entwicklung von PET-abbauenden Enzymen mit verbesserter Aktivit?t und Thermostabilit?t mittels rationalem Proteindesign. ?Wir gehen davon aus, dass der in dieser Studie verfolgte Ansatz den Weg für die Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehungen anderer Enzyme mit wesentlich h?herer PET-hydrolysierender Aktivit?t ebnet“, so Matysik.
Originaltitel der Ver?ffentlichung in “ACS Catalysis“:
"On the binding mode and molecular mechanism of enzymatic polyethylene terephthalate degradation", doi: 10.1021/acscatal.3c00259
